vguitВестник Воронежского государственного университета инженерных технологийProceedings of the Voronezh State University of Engineering Technologies2226-910X2310-1202VSUET10.20914/2310-1202-2023-4-96-101vguit-3382Research ArticleПищевая биотехнологияFood biotechnologyРазработка и получение ДНК-иммуногена на основе генов SARS-СоV-2Development and production of DNA-immunogen based SARS-CoV-2 geneshttps://orcid.org/0000-0002-9973-0753РябченковаА. А.RiabchenkovaA. A.

, научный сотрудник, 199178, г. Санкт-Петербург, вн. тер. г. муниципальный округ Васильевский, пр-кт Малый В.О., д.57

research scientist

riabchenkova@service-gene.ruhttps://orcid.org/0000-0002-1610-8935ЧиракЕ. Р.ChirakE. R.

, научный сотрудник, 199178, г. Санкт-Петербург, вн. тер. г. муниципальный округ Васильевский, пр-кт Малый В.О., д.57, Россия

research scientist

chirak.elizaveta@service-gene.ruhttps://orcid.org/0000-0001-9167-5000ЧиракЕ. Л.ChirakE. L.

научный сотрудник, 199178, г. Санкт-Петербург, вн. тер. г. муниципальный округ Васильевский, пр-кт Малый В.О., д.57, Россия

research scientist

chirak.evgenii@service-gene.ruhttps://orcid.org/0000-0002-4672-6208КолмаковН. Н.KolmakovN. N.

к.б.н.

Cand. Sci. (Biol.)

kolmakov@service-gene.ruhttps://orcid.org/0000-0002-6573-6743КопатьВ. В.KopatV. V.

директор по развитию

development director

kopat@service-gene.ruhttps://orcid.org/0000-0002-5268-9802ДуховлиновИ. В.DukhovlinovI. V.

к.б.н., директор по науке

Cand. Sci. (Biol.), director of research

atg@service-gene.ruООО «АТГ Сервис Ген»РоссияLLC ATG Service GeneRussian FederationИнститут экспериментальной медициныRussian FederationInstitution Institute of experimental medicineRussian Federation20230702202485496101Copyright © Рябченкова А.А., Чирак Е.Р., Чирак Е.Л., Колмаков Н.Н., Копать В.В., Духовлинов И.В., 20242024Рябченкова А.А., Чирак Е.Р., Чирак Е.Л., Колмаков Н.Н., Копать В.В., Духовлинов И.В.Riabchenkova A.A., Chirak E.R., Chirak E.L., Kolmakov N.N., Kopat V.V., Dukhovlinov I.V.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.vestnik-vsuet.ru/vguit/article/view/3382

В связи с развитием пандемии и необходимостью массовой вакцинации разработка вакцин нового поколения против коронавирусной инфекции COVID19 является важнейшей задачей медицины и биотехнологии. Ввиду распространенности COVID19, все еще актуально создание безопасной и протективной вакцины, особенно стимулирующей Т-клеточный иммунный ответ. В работе представлены разработка и получение ДНК-иммуногена на основе плазмидной ДНК, кодирующей гибридный белок, содержащий иммуногенные фрагменты структурных белков β-коронавируса SARS-СоV2. В результате методами генной инженерии была создана векторная конструкция на основе плазмидной ДНК, кодирующей гибридный белок, содержащий наиболее иммуногенные участки структурных белков M, S, N, E β-коронавируса SARS-СоV2, для транзиентной экспрессии в клетках млекопитающих; методом электропорации был создан штамм E.coli – продуцент ДНК-иммуногена; разработан метод очистки рекомбинантной плазмидной ДНК на основе последовательного постадийного процесса: данная методика позволила получить 100 мг ДНК-иммуногена рСМV3Таg3а-СVVV3 в растворе с концентрацией 1 мг/мл (100 мл), соответствующих установленным в Государственной Фармакопее РФ (ОФС.1.7.1.0013.18 ДНК-вакцины) параметрам качества – полученный результат стабильно воспроизводится в лабораторных условиях; были отработаны методики контроля качества плазмидной ДНК и проверена экспрессия гибридного белка методом Вестерн-блоттинга. Было показано, что антиген СVVV3 специфически связывается с иммуноглобулинами IgG из кроличьих сывороток после иммунизации ДНК-иммуногеном рСМV3Таg3А-СVVV3. Доля суперспирализованной плазмидной ДНК в образце ДНК-иммуногена рСМV3Таg3а-СVVV3 составила 85,64%, содержание эндотоксинов – менее 25 ЕЭ/мг; концентрация остаточных белков штамма-продуцента в растворе 1 мг/мл ДНК-иммуногена рСМV3Таg3А-СVVV3 составила менее 100нг на 1 мл (мг суммарной рекомбинантной ДНК).

Due to the development of the pandemic and the need for mass vaccination, the development of next-generation vaccines against COVID 19 coronavirus infection is a major challenge for medicine and biotechnology. Due to the prevalence of COVID 19, it is still urgent to develop a safe and protective vaccine, especially one that stimulates T-cell immune response. This work presents the design and production of a DNA immunogen based on plasmid DNA encoding a hybrid protein containing immunogenic fragments of structural proteins of SARS-CoV 2 β-coronavirus. As a result, a vector construct based on plasmid DNA encoding a hybrid protein containing the most immunogenic parts of structural proteins M, S, N, E of SARS-CoV 2 β-coronavirus was created by genetic engineering methods for transient expression in mammalian cells; a strain of E. coli, a producer of DNA-coronavirus β-coronavirus, was created by electroporation. coli, a DNA-immunogen producer; a method of purification of recombinant plasmid DNA was developed on the basis of a sequential step-by-step process: this method allowed to obtain 100 mg of DNA-immunogen pCMV 3Tag 3a-CVVVV3 in a solution with a concentration of 1 mg/mL (100 ml), which corresponds to the concentration established in the State Pharmacopoeia of the Russian Federation (OFS.1.7.1.0013.0013.1). .7.1.0013.18 DNA-vaccines) quality parameters - the obtained result is stably reproduced in laboratory conditions; methods of plasmid DNA quality control were worked out and expression of hybrid protein was tested by Western blotting. The CVVV3 antigen was shown to bind specifically to IgG immunoglobulins from rabbit sera after immunization with pCMV 3Tag 3A-CVVVV3 DNA-immunogen. The proportion of superhelicalized plasmid DNA in the sample of DNA-immunogen pCMV 3Tag 3A-CVVVV3 was 85.64 %, the content of endotoxins was less than 25 U/mg; the concentration of residual proteins of the strain-producer in a solution of 1 mg/ml of DNA-immunogen pCMV 3Tag 3A-CVVVV3 was less than 100ng per 1 ml (mg of total recombinant DNA).

SARS-СоV 2ДНК-иммуногенгибридный белокэкспрессияSARS-CoV 2DNA-immunogenhybrid proteinexpressionReferencesDey A. Immunogenic potential of DNA vaccine candidate, ZyCoV-D against SARS-CoV2 in animal models // Vaccine. 2021. V. 39. № 30. P. 4108–4116.Dey A. Immunogenic potential of DNA vaccine candidate, ZyCoV-D against SARS-CoV 2 in animal models. Vaccine. 2021. vol. 39. no. 30. pp. 4108–4116.Dhanda S.K. Prediction of HLA CD4 immunogenicity in human populations // Front. Immunol. 2018. V. 9. P. 1369.Dhanda S.K. Prediction of HLA CD4 immunogenicity in human populations. Front. Immunol. 2018. vol. 9. pp. 1369.Пат. № 2747762, RU, A61K 39/215, A61P 31/14, C12Q 1/6806, C07K 16/10, C12N 15/50. Вакцина для профилактики или лечения коронавирусной инфекции на основе генетической конструкции / Духовлинов И.В., Федорова Е.А., Колмаков Н.Н., Чирак Е.Л., Алексеев А.В. № 2020112937; Заявл. 05.04.2020; Опубл. 13.05.2021, Бюл. № 14.Dukhovlinov I.V., Fedorova E.A., Kolmakov N.N., Chirak E.L., Alekseev A.V. Vaccine for the prevention or treatment of coronavirus infection based on a genetic design. Patent RF, no. 2747762, 2021.He Q. Development of a Western Blot Assay for Detection of Antibodies against Coronavirus Causing Severe Acute Respiratory Syndrome // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2004. V. 11. № 2. P. 417–422.He Q. Development of a Western Blot Assay for Detection of Antibodies against Coronavirus Causing Severe Acute Respiratory Syndrome. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2004. vol. 11. no. 2. pp. 417–422.Lee J. Engineering DNA vaccines against infectious diseases // Acta Biomater. 2018. V. 80. P. 31–47.Lee J. Engineering DNA vaccines against infectious diseases. Acta Biomater. 2018. vol. 80. pp. 31–47.Momin Т. Safety and Immunogenicity of a DNA SARS-CoV2 vaccine (ZyCoV-D): Results of an open-label, non-randomized phase I part of phase I/II clinical study by intradermal route in healthy subjects in India // EClinicalMedicine. 2021. V. 38.Momin Т. Safety and Immunogenicity of a DNA SARS-CoV 2 vaccine (ZyCoV-D): Results of an open-label, non-randomized phase I part of phase I/II clinical study by intradermal route in healthy subjects in India. EClinicalMedicine. 2021. vol. 38.Rodrigues João P.G.L.M. Insights on cross-species transmission of SARS-CoV2 from structural modeling // PLoS Comput Biol. 2020. V. 16. № 12.Rodrigues João P.G.L.M. Insights on cross-species transmission of SARS-CoV 2 from structural modeling. PLoS Comput Biol. 2020. vol. 16. no. 12.Vojdania A., Kharrazianb D. Potential antigenic cross-reactivity between SARS-CoV2 and human tissue with a possible link to an increase in autoimmune diseases // Clinical Immunology. 2020. V. 217. P. 1–2.Vojdania A., Kharrazianb D. Potential antigenic cross-reactivity between SARS-CoV 2 and human tissue with a possible link to an increase in autoimmune diseases. Clinical Immunology. 2020. vol. 217. pp. 1–2.Williams J.A. Generic plasmid DNA production platform incorporating low metabolic burden seed-stock and fed-batch fermentation processes // Biotechnol Bioeng. 2010. V. 103. № 6. P. 1129–1143.Williams J.A. Generic plasmid DNA production platform incorporating low metabolic burden seed-stock and fed-batch fermentation processes. Biotechnol Bioeng. 2010. vol. 103. no. 6. pp. 1129–1143.Zhao J. Antibody responses to SARS-CoV2 in patients of novel Antibody responses to SARS-CoV2 in patients of novel coronavirus disease 2019 // Clin. Infect. Dis. 2020. V. 71. № 16. P. 2027–2034.Zhao J. Antibody responses to SARS-CoV 2 in patients of novel Antibody responses to SARS-CoV 2 in patients of novel coronavirus disease 2019. Clin. Infect. Dis. 2020. vol. 71. no. 16. pp. 2027–2034.Чащин В.П., Гудков А.Б., Попова О.Н., Одланд Ю.О. и др. Характеристика основных факторов риска нарушений здоровья населения, проживающего на территориях активного природопользования в Арктике // Экология человека. 2014. №. 1. С. 3-12.Chashchin V.P., Gudkov A.B., Popova O.N., Odland Yu.O. et al. Characteristics of the main risk factors for health problems among the population living in areas of active environmental management in the Arctic. Human Ecology. 2014. no. 1. pp. 3-12. (in Russian).Конторович А.Э., Коржубаев А.Г., Эдер Л.В. Прогноз глобального энергообеспечения: методология, количественные оценки, практические выводы // Минеральные ресурсы России. Экономика и управление. 2006. №. 5. С. 18-27.Kontorovich A.E., Korzhubaev A.G., Eder L.V. Forecast of global energy supply: methodology, quantitative estimates, practical conclusions. Mineral Resources of Russia. Economics and Management. 2006. no. 5. pp. 18-27. (in Russian).Раскина Т.А., Пирогова О.А., Зобнина О.В., Пинтова, Г.А. Показатели системы остеокластогенеза у мужчин с различными клиническими вариантами анкилозирующего спондилита // Современная ревматология. 2015. Т. 9. №. 2. С. 23-27. doi: 10.14412/1996-7012-2015-2-23-27Raskina T.A., Pirogova O.A., Zobnina O.V., Pintova, G.A. Indicators of the osteoclastogenesis system in men with various clinical variants of ankylosing spondylitis. Modern rheumatology. 2015. vol. 9. no. 2. pp. 23-27. doi: 10.14412/1996-7012-2015-2-23-27 (in Russian).Новиков А.А., Смоленский А.В., Михайлова А.В. Подходы к оценке показателей вариабельности сердечного ритма (обзор литературы) // Вестник новых медицинских технологий. Электронное издание. 2023. Т. 17. №. 3. С. 85-94.Novikov A.A., Smolensky A.V., Mikhailova A.V. Approaches to assessing heart rate variability indicators (literature review). Bulletin of new medical technologies. Electronic edition. 2023. vol. 17. no. 3. pp. 85-94. (in Russian).Абдурахманов Г.М., Лопатин И.К., Исмаилов Ш.И. Основы зоологии и зоогеографии. Москва: Академия, 2001.Abdurakhmanov G.M., Lopatin I.K., Ismailov Sh.I. Fundamentals of zoology and zoogeography. Moscow, Academy, 2001. (in Russian).Кондратьев В.Б. Глобальная фармацевтическая промышленность // Отрасли и сектора глобальной экономики: особенности и тенденции развития. 2015. С. 226-249. URL: http://perspektivy.info/rus/ekob/globalnaja_farmacevticheskaja_promyshlennost_2011-07-18.htmlKondratyev V.B. Global pharmaceutical industry. Industries and sectors of the global economy: features and development trends. 2015. pp. 226-249. Available at: http://perspektivy.info/rus/ekob/globalnaja_farmacevticheskaja_promyshlennost_2011-07-18.html (in Russian).ГОСТ 8.586.5-2005. Государственная система обеспечения единства измерений. Измерение расхода и количества жидкостей и газов с помощью стандартных сужающих устройств. М.: Стандартинформ, 2007.GOST 8.586.5-2005. State system for ensuring the uniformity of measurements. Measurement of flow and quantity of liquids and gases using standard restriction devices. Moscow, Standartinform, 2007. (in Russian).Ura T., Yamashita A., Mizuki N., Okuda K. et al. New vaccine production platforms used in developing SARS-CoV-2 vaccine candidates // Vaccine. 2021. V. 39. №. 2. P. 197-201.Ura T., Yamashita A., Mizuki N., Okuda K. et al. New vaccine production platforms used in developing SARS-CoV-2 vaccine candidates. Vaccine. 2021. vol. 39. no. 2. pp. 197-201.Chavda V.P., Pandya R., Apostolopoulos V. DNA vaccines for SARS-CoV-2: toward third-generation vaccination era // Expert Review of Vaccines. 2021. V. 20. №. 12. P. 1549-1560.Chavda V.P., Pandya R., Apostolopoulos V. DNA vaccines for SARS-CoV-2: toward third-generation vaccination era. Expert Review of Vaccines. 2021. vol. 20. no. 12. pp. 1549-1560.Borgoyakova M.B., Karpenko L.I., Rudometov A.P., Shanshin D.V. et al. Immunogenic properties of the DNA construct encoding the receptor-binding domain of the SARS-CoV-2 spike protein // Molecular Biology. 2021. V. 55. P. 889-898Borgoyakova M.B., Karpenko L.I., Rudometov A.P., Shanshin D.V. et al. Immunogenic properties of the DNA construct encoding the receptor-binding domain of the SARS-CoV-2 spike protein. Molecular Biology. 2021. vol. 55. pp. 889-898.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.