В настоящее время Российский рынок ферментных препаратов фосфолипазы А2 представлен коммерческими препаратами иностранных производителей: Nagase (Япония) и Maxapal (Нидерланды). Однако растущий спрос и необходимость снижения себестоимости производства фосфолипазы А2 требуют разработки новых суперпродуцентов фосфолипазы А2. В связи с чем целью работы является сравнительная экспрессия рекомбинантной фосфолипазы А2 в Komagataella phaffii в зависимости от модификации сигнального пептида альфа-фактора. Объектом исследования является дрожжевой штамм-реципиент Komagataella phaffii X-33. Исследования проводились в соответствии с общепринятыми нормами и подходами. Для работы использованы гены фосфолипазы А2 из Streptomyces violaceoruber. Целевые последовательности синтезированы в компании «Евроген» (Россия) и заклонированы в составе TE-вектора pUC57. В ходе выполнения работы проведена сборка генетических конструкций pPICZaA-Pla2 и PPICZmf4iA-Pla2, содержащих ген фосфолипазы А2 Streptomyces violaceoruber под нативным сигналом a-MF и его модификацией mf4i. Также проведена трансформация дрожжей Komagataella phaffii X-33 полученными генетическими конструкциями. В результате проведенных исследований показано, что в среднем достоверных отличий в уровне экспрессии и удельной активности рекомбинантной фосфолипазы А2 метилотрофными дрожжами K. Phaffii X-33 при использовании нативного сигнала секреции a-MF и его модифицированного варианта mf4i не обнаружено. Однако использование фактора секреции mf4i позволяет получить более высокую продукцию фосфолипазы А2 у отдельных клонов (трансформантов). Полученные данные указывают на перспективность использования фактора секреции mf4i для создания сверхпродуцентов ферментов на основе дрожжей K. Phaffii X-33.

1. Dennis E.A., Cao J., Hsu V.I.I., Magrioti V. et al. Phospholipase A2 enzymes: physical structure, biological function, disease implication, chemical inhibition, and therapeutic intervention // Chem Rev. 2011. V. 111. P. 6130–6185. doi: 10.1021/cr200085w

2. Samy R.P., Gopalakrishnakone P., Stiles B.G., Girish K.S. et al. Snake venom phospholipases A(2): a novel tool against bacterial diseases // Curr Med Chem. 2012. V. 19. P. 6150–6162. doi: 10.2174/092986712804485791

3. Muller V.D., Russo R.R., Cintra A.C., Sartim M.A. et al. Crotoxin and phospholipases A2 from Crotalus durissus terrificus showed antiviral activity against dengue and yellow fever viruses // Toxicon. 2012. V. 59. P. 507–515. doi: 10.1016/j.toxicon.2011.05.021

4. Muller V.D., Soares R.O., dos Santos N.N., Trabuco A.C. et al. Phospholipase A2 isolated from the venom of Crotalus durissus terrificus inactivates dengue virus and other enveloped viruses by disrupting the viral envelope // PLoS One. 2014. V. 9. №. 11. P. e112351. doi: 10.1371/journal.pone.0112351

5. Russo R.R., M?ller V.D.M., Cintra A.C.O., Figueiredo L.T.M. et al. Phospholipase A2 crotoxin B isolated from the venom of Crotalus durissus terrificus exert antiviral effect against dengue virus and yellow fever virus through its catalytic activity // J Virol Antivir Res. 2014. V. 3. P. 1. doi: 10.1016/j.toxicon.2011.05.021

6. Castillo J.C., Vargas L.J., Segura C., Guti?rrez J.M. et al. In vitro antiplasmodial activity of phospholipases A2 and a phospholipase homologue isolated from the venom of the snake Bothrops asper // Toxins (Basel). 2012. V. 4. P. 1500–1516. doi: 10.3390/toxins4121500

7. Nunes D.C., Figueira M.M., Lopes D.S., De Souza D.L. et al. BnSP7 toxin, a basic phospholipase A2 from Bothrops pauloensis snake venom, interferes with proliferation, ultrastructure and infectivity of Leishmania (Leishmania) amazonensis // Parasitology. 2013. V. 140. P. 844–854. doi:10.1017/S0031182013000012

8. Silveira L.B., Marchi-Salvador D.P., Santos-Filho N.A., Silva F.P. et al. Isolation and expression of a hypotensive and anti-platelet acidic phospholipase A2 from Bothrops moojeni snake venom // J Pharm Biomed Anal. 2013. V. 73. P. 35–43. doi: 10.1016/j.jpba.2012.04.008

9. Rodrigues R.S., Izidoro L.F., de Oliveira R.J., Sampaio S.V. et al. Snake venom phospholipases A2: a new class of antitumor agents // Protein Pept Lett. 2009. V. 16. P. 894–898. doi: 10.2174/092986609788923266

10. Borrelli G.M., Trono D. Recombinant lipases and phospholipases and their use as biocatalysts for industrial applications // Int. J.N. Sci. 2015. V. 16. P. 20774–20840. doi: 10.3390/ijms160920774

11. Murakami M., Sato H., Miki Y., Yamamoto K. et al. A new era of secreted phospholipase A2 (sPLA2) // J Lipid Res. 2015. V. 56. P. 1248–1261. doi: 10.1194/jlr.R058123

12. Quach N.D., Arnold R.D., Cummings B.S. Secretory phospholipase A2 enzymes as pharmacological targets for treatment of disease. // Biochem Pharmacol. 2014. V. 90. P. 338–348. doi: 10.1016/j.bcp.2014.05.022

13. Ahmad M., Hirtz M., Pitcher H., Schwab H. Protein expression in Pichia pastoris: recent achievements and perspectives for heterologous production // Appl Microbiol Biotechnol. 2014. V. 98. P. 5301–5317. doi: 10.1007/s00253-014-5732-5

14. Kang Z., Huang H., Zhang Y., Du G. et al. Recent advances of molecular toolbox construction expand Pichia pastoris in synthetic biology applications // World J Microbiol Biotechnol. 2017. V. 33. №. 1. P. 1-8. doi: 10.1007/s11274-016-2185-2

15. Liu A., Yu X.-W., Sha C., Xu Y. Streptomyces violaceoruber Phospholipase A2: expression in Pichia pastoris, properties, and application in oil degumming // Appl Biochem Biotechnol. 2015. V. 175. №. 6. P. 3195-3206. doi: 10.1007/s12010-015-1492-7

16. Takemori D., Yoshino K., Eba C., Nakano H. et al. Extracellular production of phospholipase A 2 from Streptomyces violaceoruber by recombinant Escherichia coli // Protein Expression and Purification. 2012. V. 81. №. 2. P. 145-150. doi: 10.1016/j.pep.2011.10.002

17. Yu X.W., Sun W.H., Wang Y.Z., Xu Y. Identification of novel factors enhancing recombinant protein production in multi-copy Komagataella phaffii based on transcriptomic analysis of overexpression effects // Sci. Rep. 2017. V. 7. №. 1. P. 1-12. doi: 10.1038/s41598-017-16577-x

18. Codon Usage Database. URL: http://www.kazusa.or.jp/codon/index.html.

19. EasySelect Pichia Expression Kit. For Expression of Recombinant Proteins Using pPICZ and pPICZ? in Pichia pastoris. User manual // Invitrogen. 2010. 86 p.

20. Valli M., Tatto N.E., Peymann A., Gruber C. et al. Curation of the genome annotation of Pichia pastoris (Komagataella phaffii) CBS7435 from gene level to protein function // FEMS yeast research. 2016. V. 16. №. 6. doi: 10.1093/femsyr/fow051