Разработка стратегии индукции АОХ1 промотора при культивировании метилотрофных дрожжей Komagataella phaffii
Аннотация
В настоящее время наблюдается значительное повышение интереса к промышленному производству ферментных препаратов (и других рекомбинантных белков) при помощи различных микроорганизмов, в том числе метилотрофных дрожжей, таких как Komagataellaphaffii. При этом наиболее значимая продуктивность целевых белков достигается при метанольной индукции гетерологичных генов, клонированных под контролем AOX1 промотора. Таким образом эффективность биосинтеза во многом определяется метаболизмом метанола. В связи с чем целью работы является разработка оптимальной стратегии метанольной индукции AOX1 промотора Komagataella phaffii.Объектом исследования является культура рекомбинантного штамма-продуцента фосфолипазы А2 Komagataellaphaffii. Исследования проводились в лабораторном ферментере InforsMinifors (Швейцария) на жидкой питательной среде BSM (BasalSaltMedium). В работе применяли общепринятые методы исследований характеристик метаболической активности, в том числе расчета удельных характеристик и продуктивности штамма. Результатом исследования является определение удельной скорости потребления метанола, используемого в качестве источника углерода, которая составила 19,2±1,8 мг/г*ч. Также в ходе выполнения работы определена удельная скорость роста Komagataella phaffii и составила 0,24 ч-1. На основании данных, полученных в ходе исследований разработана стратегия индукции AOX1 промотора при культивировании метилотрофных дрожжей Komagataellaphaffii, путем поддержания концентрации метанола в диапазоне от 0,6 до 2 % на основании концентрации растворенного кислорода в среде. Разработанная стратегия индукции AOX1 промотора позволила обеспечить получение не менее 1,87 г/л рекомбинантного белка (фосфолипаза А2) при культивировании Komagataella phaffii на протяжении 96 ч, что в 3,7 раз превосходит известные результаты.
Об авторах
Д. С. Бытяк
Воронежский государственный университет инженерных технологий
Россия
Россия
магистр, кафедра биохимии и биотехнологии, пр-т Революции, 19, г. Воронеж, 394036, Россия
О. С. Корнеева
Воронежский государственный университет инженерных технологий
д.б.н., профессор, кафедра биохимии и биотехнологии, пр-т Революции, 19, г. Воронеж, 394036, Россия
Е. А. Мотина
Воронежский государственный университет инженерных технологий
к.т.н., доцент, кафедра биохимии и биотехнологии, пр-т Революции, 19, г. Воронеж, 394036, Россия
Список литературы
1. Zavec D., Troyer C., Maresch D., Altmann F. et al. Beyond alcohol oxidase: the methylotrophic yeast Komagataella phaffii utilizes methanol also with its native alcohol dehydrogenase Adh2 // FEMS yeast research. 2021. V. 21. №. 2. P. foab009. doi: 10.1093/femsyr/foab009
2. Vogl T., Fischer J.E., Hyden P., Wasmayer R. et al. Orthologous promoters from related methylotrophic yeasts surpass expression of endogenous promoters of Pichia pastoris // AMB Express. 2020. V. 10. №. 1. P. 1-9. doi: 10.1186/s13568-020-00972-1
3. Weninger A., Hatzl, A.M., Schmid C., Vogl T. et al. Combinatorial optimization of CRISPR/Cas9 expression enables precision genome engineering in the methylotrophic yeast Pichia pastoris // Journal of biotechnology. 2016. V. 235. P. 139-149. doi: 10.1016/j.jbiotec.2016.03.027
4. Ohsawa S., Nishida S., Oku M., Sakai Y. et al. Ethanol represses the expression of methanol-inducible genes via acetyl-CoA synthesis in the yeast Komagataella phaffii // Scientific reports. 2018. V. 8. №. 1. P 1-11. doi: 10.1038/s41598-018-36732-2
5. Garc?a-Ortega X., C?mara E., Ferrer P., Albiol J. et al. Rational development of bioprocess engineering strategies for recombinant protein production in Pichia pastoris (Komagataella phaffii) using the methanol-free GAP promoter. Where do we stand? // New biotechnology. 2019. V. 53. P. 24-34. doi: 10.1016/j.nbt.2019.06.002
6. Ivanova A.V., Sidorin A.V., Sambuk E.V., Rumyantsev A.M. et al. The analysis of the polyamine oxidase genes in the methylotrophic yeast Komagataella phaffii // Ecological genetics. 2019. V. 17. №. 4. P. 47-55. doi: 10.17816/ecogen17447-55
7. Dalvie N.C., Leal J., Whittaker C.A., Yang Y. et al. Host-informed expression of CRISPR guide RNA for genomic engineering in Komagataella phaffii // ACS synthetic biology. 2019. V. 9. №. 1. P. 26-35. doi.: 10.1021/acssynbio.9b00372
8. Barrero J.J., Casler J.C., Valero F., Ferrer P. et al. An improved secretion signal enhances the secretion of model proteins from Pichia pastoris // Microbial cell factories. 2018. V. 17. №. 1. P. 1-13. doi: 10.1186/s12934-018-1009-5
9. C?mara E., Landes N., Albiol J., Gasser B. et al. Increased dosage of AOX1 promoter-regulated expression cassettes leads to transcription attenuation of the methanol metabolism in Pichia pastoris // Scientific reports. 2017. V. 7. №. 1. P. 1-16. doi: 10.1038/srep44302
10. Jord? J., Jouhten P., C?mara E., Maaheimo H. et al. Metabolic flux profiling of recombinant protein secreting Pichia pastoris growing on glucose: methanol mixtures // Microbial cell factories. 2012. V. 11. №. 1. P. 1-14. doi: 10.1186/1475-2859-11-57
11. Ru?mayer H., Buchetics M., Gruber C., Valli M. et al. Systems-level organization of yeast methylotrophic lifestyle // BMC biology. 2015. V. 13. №. 1. P. 1-25. doi: 10.1186/s12915-015-0186-5
12. Murakami M., Taketomi Y., Sato H., Yamamoto K. Secreted phospholipase A2 revisited // The Journal of Biochemistry. 2011. V. 150. №. 3. P. 233-255. doi: 10.1093/jb/mvr088
13. Murakami M., Sato H., Miki Y., Yamamoto K. et al. A new era of secreted phospholipase A2 // Journal of lipid research. 2015. V. 56. №. 7. P. 1248-1261. doi: 10.1194/jlr.R058123
14. Seresht A.K., Norgaard P., Palmqvist E.A., Andersen A.S. et al. Modulating heterologous protein production in yeast: the applicability of truncated auxotrophic markers // Applied microbiology and biotechnology. 2013. V. 97. №. 9. P. 3939-3948. doi: 10.1007/s00253-012-4263-1
15. Rosenson R.S., Hurt-Camejo E. Phospholipase A2 enzymes and the risk of atherosclerosis // European heart journal. 2012. V. 33. №. 23. P. 2899-2909. doi: 10.1093/eurheartj/ehs148
16. Idiris A., Tohda H., Kumagai H., Takegawa K. Engineering of protein secretion in yeast: strategies and impact on protein production // Applied microbiology and biotechnology. 2010. V. 86. №. 2. P. 403-417. doi: 10.1007/s00253-010-2447-0
17. Wang J., Wang X., Shi L., Qi F. et al. Methanol-independent protein expression by AOX1 promoter with trans-acting elements engineering and glucose-glycerol-shift induction in Pichia pastoris // Scientific reports. 2017. V. 7. №. 1. P. 1-12. doi: 10.1038/srep41850
18. Самойлова Ю.В., Тулупов А.А., Сорокина К.Н. Современные подходы к разработке новых ферментов липаз и продуцентов на их основе // Вестник Новосибирского государственного университета. Серия: Биология, клиническая медицина. 2014. Т. 12. № 4.
19. Корнеева О.С. Анненков В.А. Получение ферментного препарата липазы методом рекомбинантных ДНК // Технологии пищевой и перерабатывающей промышленности АПК – продукты здорового питания. 2014. № 3.
20. Пат. № 2501014, RU, G01N 33/50, 33/48. Способ определения липолитической активности в субклеточных фракциях бактерий / Козлов С.Н., Марков Е.Ю., Николаев В.Б., Урбанович Л.Я. и др. №2012132418/15; Заявл. 15.08.2012; Опубл. 10.12.2013, Бюл. № 34.
Для цитирования:
Бытяк Д.С., Корнеева О.С., Мотина Е.А. Разработка стратегии индукции АОХ1 промотора при культивировании метилотрофных дрожжей Komagataella phaffii. Вестник Воронежского государственного университета инженерных технологий. 2021;83(1):115-120. https://doi.org/10.20914/2310-1202-2021-1-115-120
For citation:
Bytyak D.S., Korneeva O.S., Motina E.A. Development of a strategy induction AOX1 promoter methylotrophic yeast Komagataella phaffii. Proceedings of the Voronezh State University of Engineering Technologies. 2021;83(1):115-120. (In Russ.) https://doi.org/10.20914/2310-1202-2021-1-115-120
Просмотров: 149
Послать статью по эл. почте 
Оставить комментарий 
